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附錄Ⅻ A 無菌檢查法

來源: 發(fā)布時間:2019-08-28

附錄Ⅻ A    無菌檢查法
無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定,僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。
無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度 10 000 級下的局部潔凈度 100 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行,其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證,其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗(yàn)還需對試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。
無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識,并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基的制備
培養(yǎng)基可按以下處方制備,亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在 2℃~ 25℃、避光的環(huán)境,若保存于非密閉容器中,一般在三周內(nèi)使用;若保存于密閉容器中,一般可在一年內(nèi)使用。
1. 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基
酪胨 (胰酶水解)    15.0g       酵母浸出粉                    5.0g
葡萄糖            5.0g        氯化鈉                        2.5g
L-胱氨酸          0.5g        新配制的 0.1% 刃天青溶液      1.0 ml
硫乙醇酸鈉          0.5g      瓊脂                          0.75g  
(或硫乙醇酸)      ( 0.3 ml)     水                           1000 ml
除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微溫溶解,調(diào)節(jié) pH 為弱堿性,煮沸,濾清,加入葡萄糖和刃天青溶液,搖勻,調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.1 ± 0.2 。分裝至適宜的容器中,其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層(粉紅色)不超過培養(yǎng)基深度的 1/2 ,滅菌。在供試品接種前,培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的 1/5 ,否則,須經(jīng) 100 ℃水浴加熱至粉紅色消失(不超過 20 分鐘),迅速冷卻,只限加熱一次,并防止被污染。
2.改良馬丁培養(yǎng)基
胨               5.0g            磷酸氫二鉀           1.0g
酵母浸出粉       2.0g            硫酸鎂               0.5g
葡萄糖          20.0g            水                 1000 ml
除葡萄糖外,取上述成分混合,微溫溶解,調(diào)節(jié) pH 值約為 6.8 ,煮沸,加入葡萄糖溶解后,搖勻,濾清,調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 6.4 ± 0.2 ,分裝,滅菌。
3.選擇性培養(yǎng)基
按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法,在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑,其用量同驗(yàn)證試驗(yàn)。
4.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基
胨                  10.0g         氯化鈉                 5.0g
牛肉浸出粉           3.0g          水                   1000 ml
取上述成分混合,微溫溶解,調(diào)節(jié) pH 為弱堿性,煮沸,濾清,調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.2 ± 0.2 ,分裝,滅菌。
5. 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
按上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的處方及制法,加入 14.0g瓊脂,調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.2 ± 0.2 ,分裝,滅菌。
6. 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基
按改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法,加入 14.0g瓊脂,調(diào)節(jié) pH值使滅菌后為 6.4 ± 0.2,分裝,滅菌。
培養(yǎng)基的適用性檢查
無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。
無菌性檢查  每批培養(yǎng)基隨機(jī)抽取不少于 10 支(瓶),5支(瓶)置30℃~35℃另5支(瓶)置20℃~25℃培養(yǎng) 14 天,均應(yīng)無菌生長.
靈敏度檢查
菌種:培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過 5 代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0 代),試驗(yàn)用菌種應(yīng)采用適宜的菌種保存技術(shù)進(jìn)行保存,以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。
金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)〔CMCC(B)63 501〕
生孢梭菌( Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌( Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲霉( Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
菌液制備   接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中,30℃~35℃培養(yǎng)18小時~24小時;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上,20℃~25℃培養(yǎng)24小時~48小時,上述培養(yǎng)物用 0.9%氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于 100 cfu(菌落形成單位)的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上,23℃~28℃培養(yǎng) 5天~7天,加入 3ml~5ml 無菌的含 0.05%(v/v)聚山梨酯 80的0.9%氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用無菌的含 0.05%(v/v)聚山梨酯 80的0.9%氯化鈉溶液制成每 1ml含孢子數(shù)小于100 cfu的孢子懸液。
菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時內(nèi)使用,若保存在2℃~8℃可在24小時內(nèi)使用。    黑曲霉孢子懸液可保存在2℃~8℃,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。
培養(yǎng)基接種  取每管裝量為 12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 9支,分別接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各 2支,另 1支不接種作為空白對照,置30℃~35℃培養(yǎng)3天;取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支,分別接種小于 100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各 2支,另 1支不接種作為空白對照,置20℃~25℃培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。
結(jié)果判定  空白對照管應(yīng)無菌生長,若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好,判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。
稀釋液、沖洗液及其制備方法
稀釋液、沖洗液配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。
1. 0.1%蛋白胨水溶液  取蛋白胨 1.0g,加水 1000ml,微溫溶解,濾清,調(diào)節(jié) pH值至 7.1±0.2,分裝,滅菌。
2. pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀 3.56g ,磷酸氫二鈉 7.23g,氯化鈉4.30g,蛋白胨 1.0g,加水 1000ml ,微溫溶解,濾清,分裝,滅菌。
3. 0.9%氯化鈉溶液  取氯化鈉9.0g,加水溶解使成1000ml,過濾,分裝,滅菌(僅用于上述兩種溶液不適用時使用)。
4. 根據(jù)供試品的特性,可選用其他經(jīng)驗(yàn)證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。
如需要,可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。
方法驗(yàn)證試驗(yàn)
當(dāng)建立產(chǎn)品的無菌檢查法時,應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證,以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。若該產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時,檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。
驗(yàn)證時,按"供試品的無菌檢查"的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。
菌種及菌液制備  同培養(yǎng)基靈敏度檢查。
薄膜過濾法  取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾,沖洗,在最后一次的沖洗液中加入小于100 cfu的試驗(yàn)菌,過濾。將培養(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器,加入等量試驗(yàn)菌,作為對照,細(xì)菌置30℃~35℃、真菌置20℃~25℃培養(yǎng)3天~5天,逐日觀察各濾筒內(nèi)試驗(yàn)菌的生長情況。
直接接種法  取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8 管,分別接入小于 100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各 2管,取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基 4管,分別接入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各 2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定量的供試品量,另 1管作為對照,細(xì)菌置30℃~35℃、真菌置20℃~25℃培養(yǎng)3天~5天,逐日觀察各濾筒內(nèi)試驗(yàn)菌的生長情況。
結(jié)果判斷  與對照管比較,如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好,則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì),照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長,則說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用,可采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法,消除供試品的抑菌作用,并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。
驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的無菌檢查同時進(jìn)行。
供試品的無菌檢查
抽驗(yàn)數(shù)量  是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量(支或瓶)。成品每亞批均應(yīng)進(jìn)行無菌檢查。除另有規(guī)定外,原液、半成品及成品按表1規(guī)定,上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2規(guī)定。
接種量  是指每個最小包裝的最少取樣量(ml或g)。除另有規(guī)定外,接種供試品量按表3規(guī)定。若采用直接接種法,按接種量要求等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基中(兩種培養(yǎng)基的接種支/瓶數(shù)之比為2:1);若采用薄膜過濾法,應(yīng)采用三聯(lián)薄膜過濾器,其中兩聯(lián)加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,另一聯(lián)加入改良馬丁培養(yǎng)基。只要供試品特性允許,應(yīng)將所有容器內(nèi)的內(nèi)容物全部過濾。
陽性對照  以金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌。供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照試驗(yàn)的菌液制備同培養(yǎng)基靈敏度檢查項(xiàng)下金黃色葡萄球菌菌液制備方法,加菌量小于 100cfu。陽性對照也可在供試品無菌檢查培養(yǎng)14天后,取其中一份硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基,加入小于 100cfu陽性對照菌,作為陽性對照。陽性對照置30℃~35℃培養(yǎng) 48小時~72小時應(yīng)生長良好。
陰性對照  供試品無菌檢查時,應(yīng)取相應(yīng)溶劑、稀釋液和沖洗液同法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
無菌試驗(yàn)過程中,若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑,應(yīng)證明其有效性,且對微生物生長無毒性。
無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許,應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品的無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與驗(yàn)證的方法相同。
操作時,用適宜的消毒液對供試品容器表面進(jìn)行徹底消毒,如果供試品容器內(nèi)有一定的真空度,可用適宜的無菌器材(如帶有除菌過濾器的針頭)向容器內(nèi)導(dǎo)入無菌空氣,再按無菌操作起開容器取出內(nèi)容物。
供試品處理及接種培養(yǎng)基
除另有規(guī)定外,按下列方法進(jìn)行。
1.薄膜過濾法
采用封閉式薄膜過濾器,濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45μm,直徑約為 50mm。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。使用時,應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。
水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般為100ml,總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。
水溶液供試品  取規(guī)定量,裝量小于10ml者,全部轉(zhuǎn)移至含適宜稀釋液300ml的無菌容器內(nèi),混勻,立即過濾;裝量為10ml及以上者直接過濾,或全部轉(zhuǎn)移至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi),混勻,立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑,須用沖洗液沖洗濾膜,沖洗次數(shù)一般不少于三次,所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。沖洗后,兩個濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基各100ml,另一濾器中加入改良馬丁培養(yǎng)基100ml。
水溶性固體供試品  取規(guī)定量,加適宜的稀釋液溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶,然后照水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。
非水溶性供試品 取規(guī)定量,混合溶于含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液300ml的無菌容器內(nèi),充分混合,立即過濾。用含0.1%~1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜,沖洗次數(shù)一般不少于三次。加入含或不含聚山梨酯80的培養(yǎng)基。其他照水溶液供試品項(xiàng)下的方法操作。
可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品  取規(guī)定量,混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯①中,劇烈振搖,使供試品充分溶解,如果需要可適當(dāng)加熱,但溫度不得超過44℃,趁熱迅速過濾。對仍然無法過濾的供試品,于含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試液中加入不少于100ml的稀釋液,充分振搖萃取,靜置,取下層水相作為供試液過濾。過濾后濾膜沖洗及加入培養(yǎng)基照非水溶性制劑供試品項(xiàng)下的方法操作。
無菌氣(噴)霧劑供試品  取規(guī)定量,將各容器置至少-20℃的冰室冷凍約1小時。以無菌操作迅速在容器上端鉆一小孔,釋放拋射劑后再無菌開啟容器,并將供試液轉(zhuǎn)移至無菌容器中,然后照水溶液或非水溶性制劑供試品項(xiàng)下的方法操作。
裝有藥物的注射器供試品 取規(guī)定量,將注射器中的內(nèi)容物(若需要可吸入稀釋液或標(biāo)簽所示的溶劑溶解)直接過濾,或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi),混勻,立即過濾。然后按水溶性供試品項(xiàng)下方法操作。
同時應(yīng)采用直接接種法進(jìn)行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。
注: ①無菌十四烷酸異丙酯的制備 采用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑為0.22μm的脂溶性濾膜(140℃干熱滅菌2小時)過濾。
2. 直接接種法
直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查的供試品。  取規(guī)定量供試品,等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基中(兩種培養(yǎng)基的接種支/瓶數(shù)之比為2:1)。除另有規(guī)定外,每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的 10%,同時,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于 15ml,改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。
混懸液等非澄清水溶液供試品  取規(guī)定量,等量分別接種至各管培養(yǎng)基中。
固體供試品  取規(guī)定量,加入適宜的稀釋劑溶解,或按標(biāo)簽說明復(fù)溶后,混合,等量分別接種至各管培養(yǎng)基中。
非水溶性供試品 取規(guī)定量,混合,加入適量的聚山梨酯 80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化,等量分別接種至各管培養(yǎng)基中。或等量分別直接接種至含聚山梨酯 80或其它適宜乳化劑的各管培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)及觀察
將上述接種后的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基平均分成兩份,一份置30℃~35℃培養(yǎng) 14天;另一份與接種后的改良馬丁培養(yǎng)基置20℃~25℃培養(yǎng) 14天,培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁,培養(yǎng) 14天后,不能從外觀上判斷有無菌生長,可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中及營養(yǎng)瓊脂斜面和改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上,細(xì)菌培養(yǎng) 2天、真菌培養(yǎng) 3天,觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂和改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上是否有菌生長;或取培養(yǎng)液(物)涂片,染色,鏡檢,判斷是否有菌,必要時作菌種鑒定。
                        結(jié)果判斷
陽性對照管應(yīng)生長良好,陰性對照管不得有菌生長。否則,試驗(yàn)無效。
若供試品管均澄清,或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長,判供試品符合規(guī)定;若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長,判供試品不符合規(guī)定,除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無效,即生長的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少一個條件時方可判試驗(yàn)結(jié)果無效:
⑴ 無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。
⑵ 回顧無菌試驗(yàn)過程,發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。
⑶  供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后,確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和(或)無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。
試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效,應(yīng)重試。重試時,重新取同量供試品,依法檢查,若無菌生長,判供試品符合規(guī)定;若有菌生長,判供試品不符合規(guī)定。                      
表1 出廠制品不同規(guī)格及原液和半成品最少抽驗(yàn)數(shù)量
供試品
批產(chǎn)量(N);裝量(V)
最少抽驗(yàn)數(shù)量
注射劑
N≤100
5個
100<N≤500
10個
N>500
20個
凍干血液制品
V>5ml
每柜凍干N≤200個
5個
每柜凍干N>200個
10個
V≤5ml
N≤100
5個
100<N≤500
10個
N>500
20個
原液或半成品
每個容器取樣,取樣量為每個容器制品總量的0.1%或不少于10ml。每開瓶一次,應(yīng)如上法抽驗(yàn)。體外用診斷制品半成品每
批抽驗(yàn)量應(yīng)不少于3ml。
表2上市制品監(jiān)督抽驗(yàn)數(shù)量
品種及裝量(V)
最少抽驗(yàn)數(shù)量
血液制品   V<50ml
6個
          V≥50ml  
2個
其他生物制品
10個
表3 不同規(guī)格制品的最少接種量
規(guī)格
每支(瓶)供試品的最少接種量
液體制劑(ml)         ≤1
全量
                     1<V≤5
半量
                     5<V<20
2ml
                    20≤V<50
10ml
                     V≥50
半量
原液或半成品
半量
固體制劑             <50mg
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